近日，我院古志远教授课题组在纳米孔传感分析领域取得重要研究进展。相关成果以“Native globular ferritin nanopore sensor”为题发表在《Nature Communications》上。文章链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-60322-2。

纳米孔技术是一项实时、无标记的单分子传感技术，其在DNA测序、蛋白测序和生物标志物检测等方面都有广泛应用。具有跨膜性质的通道蛋白是纳米孔技术的核心，为了提高检测分辨率和扩大分析物检测范围，开发新型纳米孔通道是十分必要的。从仿生学角度出发，桶状的跨膜结构是构建新型纳米孔传感器最理所应当的选择，然而，这可能会导致忽略掉其他结构的候选蛋白。

铁蛋白是生命体体内的一种球状储铁蛋白，可以通过吸收和释放铁离子维持生命体的铁平衡。其表面有多个亲水通道用于输运铁离子，该通道尺寸为3-5 Å，理应具有良好的分辨率。此外，铁蛋白表面具有多个疏水位点，可作为其与磷脂分子的结合位点，使铁蛋白具备嵌入磷脂双分子层的能力。

基于此，我校化科院古志远教授团队构建了一种基于铁蛋白的纳米孔传感器，并在Cu2+的辅助下，实现了对半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和若干半胱氨酸二肽的检测和区分。

图1. 铁蛋白纳米孔的结构、离子输运特性和MD模拟。（a-c）铁蛋白结构和铁蛋白-磷脂系统示意图。（d）铁蛋白纳米孔的电压门控行为。（e-f）铁蛋白纳米孔的I-V曲线和电导。（g-h）铁蛋白-磷脂体系的MD模拟。

该工作将天然马脾铁蛋白嵌入磷脂膜中，构建了基于铁蛋白的跨膜离子通道。通过单通道电流分析，作者发现铁蛋白纳米孔通道具有电压门控行为和非对称I-V特性，在+40 mV电压下，铁蛋白纳米孔通道的电导为0.497 nS。多尺度分子动力学（MD）模拟表明，铁蛋白的疏水（C4）通道稳定地嵌在磷脂双分子层中，亲水（C3）通道连通膜两侧的电解质溶液，以此形成稳定的铁蛋白跨膜通道。（图1）

图2. 铁蛋白纳米孔在Cu2+辅助下检测Cys和Hcy。（a）铁蛋白纳米孔检测示意图。（b-c）铁蛋白纳米孔检测Cys和Hcy的电流轨迹图。（d）Cys和Hcy信号的散点图。（e）Cys和Hcy信号的柱状图。

作者利用铁蛋白纳米孔对Cys和Hcy进行了检测。利用铁蛋白纳米孔单独检测Cys和Hcy时，并未观察到电流阻塞信号，而在等量Cu2+的辅助下，则能观察到Cys和Hcy导致的不同阻塞信号。（图2）Cu2+和Cys自身均不会产生阻塞信号，当在Cys的基础上加入Cu2+，阻塞信号逐渐产生，再加入EDTA螯合Cu2+后，信号则会消失。结合一系列纳米孔对照实验和理论计算，作者对该现象背后的机理进行了探索。结果表明，Cys的巯基和氨基与Cu2+形成的S-Cu-N五元环结构1：1复合物是引起纳米孔信号的关键物质。（图3）

图3. 影响铁蛋白纳米孔事件的因素。（a-c）Cu2+的背景信号其对Cys检测的影响。（d-e）缓冲试剂和pH对Cys事件频率的影响。（f-i）Cys及其类似物的纳米孔电流轨迹图。（j）Cu2+与Cys浓度比例对事件频率的影响。（k）Cys-Cu复合物的两种可能结构。

此外，作者结合MD模拟和对照实验探索了Cys-Cu复合物在铁蛋白通道内的结合位点。多尺度MD模拟表明，铁蛋白C3亲水通道中的His114、Cys126和Glu130位点在结合Cys-Cu复合物过程中起到重要作用。C3通道中的Cys126和Glu130首先捕获进入通道的Cys-Cu复合物，而后Cys的氨基与His114的咪唑基之间形成强氢键，Cys-Cu复合物以此结构被捕获在C3通道中。（图4）Zn2+与C3通道内His114、Cys126和Glu130位点有强的相互作用。作者在体系中加入过量Zn2+并统计不同Zn2+浓度下Cys事件的产生频率，结果表明，随Zn2+浓度增大，Cys事件频率降低，表明该三个残基是Cys-Cu复合物的重要结合位点。

图4. Cys-Cu与铁蛋白C3通道结合方式的MD模拟。（a-c）铁蛋白模型构建及Cys-Cu复合物在C3通道内结合方式的示意图。（d）Cys-Cu复合物与His114，Cys126和Glu130相互作用的动力学模拟。（e-g）C3通道在Cys-Cu复合物结合前后的孔径变化模拟。

图5. 铁蛋白纳米孔检测Cys二肽。（a-c）CR、CK和CF的结构示意图。（b-d）CR、CK和CF的纳米孔电流轨迹图。（e-f）CF、CK、CR和Cys事件的散点图和柱状图。

最后，作者利用铁蛋白纳米孔对基于半胱氨酸的二肽进行了检测。铁蛋白纳米孔在Cu2+辅助下实现了对半胱氨酸-苯丙氨酸（CF），半胱氨酸-赖氨酸（CK）和半胱氨酸-精氨酸（CR）三种二肽的检测和区分。（图5）

我校生科院博士后（2024届化科院博士）殷云栋、化科院青年教师张于微和硕士宋熙童为共同第一作者，我院古志远教授为通讯作者。南京师范大学微生物技术国家重点实验室为第一单位。本研究得到国家自然科学基金、江苏省合成生物学基础研究中心等项目资助。